Badanie immunohistochemiczne

Czym jest badanie immunohistochemiczne?

Badanie immunohistochemiczne (IHC) polega na detekcji poszukiwanych antygenów w pobranym materiale od pacjenta, poprzez zastosowanie odpowiednio znakowanych przeciwciał. Dokładniej rzecz ujmując, w pobranym od pacjenta materiale cytologicznym (pobrane komórki) lub histologicznym (pobrane fragmenty tkanek), wykonuje się reakcję w wyniku której (jeżeli antygeny są obecne), dochodzi do utworzenia barwnych kompleksów antygen-przeciwciało.

Są to trwałe substancje, nierozpuszczalne w wodzie i doskonale widoczne pod mikroskopem. Dzięki temu jednoznacznie wiadomo, że u pacjenta występuje konkretny antygen charakterystyczny dla danej choroby. Badanie immunohistochemiczne pozwala również ocenić wrażliwość ogniska chorobowego na lek, dzięki temu można sprawdzić czy dany lek i rodzaj terapii załagodzi objawy choroby.

Co to jest antygen, a co to jest przeciwciało?

Antygen jest substancją białkową, charakteryzującą się możliwością wyprodukowania swoistych przeciwciał przez system odpornościowy organizmu, inaczej mówiąc posiada zdolność wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko sobie. Ta cecha określana jest mianem immunogenności. Drugą cechą antygenu jest zdolność wiązania z pewnymi, określonymi przeciwciałami – tzw. antygenowość.

Przeciwciała, są to substancje białkowe należące do immunoglobulin. Są one wytwarzane przez układ odpornościowy organizmu i posiadają zdolność swoistego łączenia się z antygenami.

Zastosowanie badania immohistochemicznego

Badanie immunohistochemiczne wykorzystuje się w różnicowaniu chorób, wykorzystywane jest szczególnie w diagnostyce chorób nowotworowych pozwalając określić ich charakter – łagodne czy złośliwe. Dzięki badaniu można określić immunofenotyp nowotworu (jest to opis cech komórki poprzez określenie ekspresji konkretnych antygenów). Badanie immunohistochemiczne pozwala określić stopień zaawansowania nowotworu, a także wskazać na miejsce pochodzenia przerzutów, tzn. określić pierwotne miejsce guza.

Niekiedy badanie immunohistochemiczne stosuje się celem określania wrażliwości ogniska chorobowego na stosowany lek, a także w wielu badaniach biologicznych.

Przygotowanie próbki do badania immunohistochemicznego

W przygotowaniu próbki ważną rolę odgrywa proces znakowania (barwienia) miejsca połączenia antygenu z przeciwciałem. Preparatami stosowanymi w tym celu są:

• fluorochromy – są to barwniki fluorescencyjne umożliwiające analizę preparatów w mikroskopie fluorescencyjnym.
• enzymy – po zastosowania enzymów: peroksydazy albo fosfatazy zasadowej analiza preparatu możliwa jest w mikroskopie świetlnym albo elektronowym.
• metale – stosuje się szczególnie ferrytynę (białko zawierające żelazo), koloidalne złoto, po tym barwieniu obserwację można prowadzić w mikroskopie elektronowym.

Kolejnym ważnym elementem badania jest przygotowania próbki do analizy mikroskopowej. Można ten element badania podzielić na trzy etapy:

1. utrwalanie,
2. odwadnianie,
3. zatapianie.

Istotne jest, aby poszczególne etapy nie zaburzyły wewnętrznej budowy komórek lub tkanek poprzez denaturację białek lub przyłączenie nowych grup chemicznych do antygenów. To działanie utrudni rozpoznanie antygenu przez przeciwciało. Warto zastosować doświadczalny dobór czynników.

Proces utrwalania odbywa się przy udziale specjalnych odczynników immunohistochemicznych, produkowanych przez odpowiednie firmy. Jeżeli takowe są niedostępne, utrwalanie przeprowadza się za pomocą alkoholu lub aldehydu (np. formalina). Głównym zadaniem utrwalania jest zachowanie materiału badanego w jego pierwotnej postaci. Celem utrwalenia jest zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach i tkankach, a także wstępne utwardzenie próbki i zwiększenie jej odporności. Czas trwania utrwalania uzależniony jest od wyboru czynnika utrwalającego, rodzaju badanej tkanki, a także wielkość wycinka – przeważnie nie jest on krótszy niż 12 godzin.

Następnym ważnym elementem przygotowania próbki jest jej odwodnienie. Biorąc pod uwagę, że komórki są zbudowane w dużej ilość z wody należy ją stopniowo usunąć. Nagłe pozbycie się wody może doprowadzić do obkurczenia, a tym samym zniszczenia komórek przeznaczonych do badania. Aby tego uniknąć stopniowo przepaja się materiał alkoholem, poczynając od 50%, następnie 70%, 80%, 90%, 96%, w następnej kolejność stosując etanol bezwodny 99,8%, dalej mieszaninę etanol – ksylem, a na samym końcu sam ksylen.

Dalszy etap badanego materiału (tkanki) to umieszczenie go w mieszaninie ksylenu i parafiny w temperaturze 52°C, a następnie w ciekłej parafinie na kilka godzin. Na końcu tkankę umieszcza się w metalowej formie i zalewa się parafiną tworząc tzw. bloczek parafinowy. Alternatywą tego procesu jest zamrażanie materiału doprowadzając do utwardzenia próbki. Zamrażanie odbywa się przy użyciu ciekłych gazów lub w kriostacie.

W następnej kolejności odbywa się krojenie preparatów przy użyciu mikrotomu, otrzymując cienkie skrawki próbki grubości ok. 50-100µm. Wyróżnia się następujące rodzaje mikrotomów: rotacyjny, wahadłowy oraz saneczkowy.

Jak wygląda badanie immunohistochemiczne?

Wykonanie badania immunohistochemicznego odbywa się przy użyciu mikroskopu świetlnego oraz elektronowego. Używając mikroskopu świetlnego reakcję immunohistochemiczną wykonuję się na szkiełku podstawowym lub nakrywkowym. Przed wykonaniem samej reakcji należy wykonać blokowanie miejsc nieswoiście wiążących. Etap ten wykonuje się stosując inkubację preparatów z nieaktywną immunologicznie surowicą – nie zawierającą swoistych przeciwciał.

Proces ten ma na celu wyeliminowanie miejsc, które mogłyby nieswoiście wiązać białka osoczowe, czyli np. przeciwciała. Następnie w temperaturze pokojowej przeprowadza się inkubację ze znakowanymi przeciwciałami w tzw. komorze wilgotnej. Należy rozpuścić przeciwciała w soli fizjologicznej, ewentualnie z dodatkiem preparatów zwiększających przepuszczalność ich błon biologicznych. Po zakończonym procesie inkubacji, niezwiązane przeciwciała należy wypłukać buforowaną solą fizjologiczną. Przed zamknięciem preparatów, można je dodatkowo podbarwić, stosując odpowiednie barwniki histologiczne. Proces kończący przygotowanie próbki do oceny mikroskopowej opiera się na zamknięciu preparatu, przy użyciu soli fizjologicznej, glicerolu lub też alkoholu.

Ocena preparatu przy użyciu mikroskopu elektronowego można podzielić na dwie metody:

• przed zatopieniem materiału (preembedding) – wykonuje się ją na fragmentach tkanek lub grubych skrawkach. Dopiero po przeprowadzeniu reakcji próbkę się zatapia i kroi na ultramikrotonie na cienkie paski. Najbardziej wartościowymi preparatami są te pochodzące z powierzchownych obszarów materiału, gdyż tam występuje najsilniejsze wiązanie antygen – przeciwciało.
• na skrawkach ultracienkich (postembedding) – wykonuje się po procesie zatopienia materiału badanego, ultracienkie fragmenty preparatu umieszcza się na siatkach nylonowych albo złotych, a następnie poddaje się je inkubacji w komorze wilgotnej układając je na powierzchni roztworu z przeciwciałami.